Родился 9 июня 1810 г. в Кенигсберге. Отец, учитель пения, мечтая об исполнительской карьере сына, подвергал его многочасовым тренировкам за фортепиано. Не выдержав жестокой пианистической муштры, 16-летний Николаи сбежал из дома. Попав в Берлин, молодой музыкант продолжил свое образование у Б. Клейна и К. Цельтера. Впоследствии он занимался с итальянским композитором и педагогом Баини.

В 1833 г. Николаи становится органистом прусского посольства в Риме. Служебные обязанности не помешали творческой деятельности музыканта. За годы пребывания в Италии он создал ряд оперных произведений («Генрих II», 1839; «Храмовник», 1840, и др.), имевших у слушателей столь же быстрый, сколь и преходящий успех.

В 1841 г. Николаи перебирается в Вену. Он возглавляет здесь придворную капеллу, организует Филармонические концерты, сыгравшие впоследствии важную роль в культурной жизни страны.

С 1847 г. он — в Берлине. Придворный капельмейстер и дирижер хора кафедрального собора, Николаи одновременно много сочиняет. Его фортепианные и вокальные пьесы получают довольно широкую известность в стране.

Венцом творческих успехов Николаи стала премьера его последней оперы — «Виндзорские проказницы» (1849). Обаятельная музыкальная комедия, непринужденно смешивающая юмор и лирику, фантастику и реальность, она завоевала дружные симпатии соотечественников композитора и зарубежных слушателей. Популярность сочинения отнюдь не уменьшилась со временем: «Виндзорские проказницы» и в наши дни бытуют в репертуаре оперных театров.

Умер Отто Николаи 11 мая 1849 г. в Берлине.